作者：王友志, 高洁, 杨志谋. 短肽自组装水凝胶的温和制备方法及免疫佐剂应用[J]. 高分子学报,参考文献可阅读期刊原文

摘要

短肽自组装水凝胶是一种新型的软物质材料，它由短肽通过自组装形成，具有生物活性和生物相容性高、易于设计与合成以及对外部刺激能快速响应等优点，它在生物医药、分析检测、组织工程等领域有很高的应用前景.本文主要总结了我们近年来在短肽自组装水凝胶温和制备方法研发方面的工作，同时介绍了短肽自组装水凝胶在疫苗佐剂方面的创新应用，并探讨了短肽自组装水凝胶研究领域的挑战及研究热点.

水凝胶在我们的日常生活中随处可见，如果冻、发胶、眼膏等.由于它是一种富含水的物质(水含量通常高达90%以上)，接近于人体很多组织如肝脏、眼球玻璃体等，它在组织工程、药物递送、再生医学等领域有很高的应用前景.根据其组成成分，水凝胶可分为高分子水凝胶和小分子水凝胶；而根据成胶方式，它又可分为由共价交联得到的共价水凝胶和由非共价键相互作用力而成的物理水凝胶.天然高分子或者人工合成高分子可通过共价交联也可以通过非共价键作用力形成水凝胶[1~12]，而小分子只能通过非共价键作用力自组装形成水凝胶.高分子水凝胶在日常生活(退热贴等)、农业(植物保水剂等)、生物医学(防粘连等)等领域均实现了实际应用.而小分子水凝胶作为一种新型水凝胶，是近年来科研的热点.

小分子水凝胶是一种由小分子(分子量通常低于2000)通过自组装而成的水凝胶[13, 14].能成胶的小分子称为成胶因子，成胶因子通过非共价键作用，如氢键、π-π作用、疏水作用、主客体相互作用、正负电荷相互作用力以及配位键等自发的形成能在水溶液中稳定存在的三维网络，从而包裹水分子等物质形成水凝胶.由于非共价键作用力是可逆、可控的，小分子水凝胶往往显现出可逆、可控的成胶行为，是一种智能的水凝胶.成胶因子通常是富含氢键的两亲性分子，如糖衍生物[15]、芳香杂环化合物[16]、氨基酸衍生物[17]、多肽及其衍生物[18~23]等.其中，短肽类成胶因子由于其良好的生物活性和生物相容性、易于设计和合成、对外部刺激的快速响应性等特性，吸引了学术界广泛的研究兴趣.在过去的20年间，基于短肽的小分子水凝胶在药物递送[24~27]、组织工程[28]、肿瘤抑制[29~31]、分析检测[32~34]和疫苗佐剂[35, 36]等生物医药领域显现了很好的应用前景.

常见的短肽水凝胶的成胶方法包括加热-冷却法、pH值调节法、离子强度改变法、超声成胶法、有机溶剂助溶法等[21, 23, 28, 37, 38].这些成胶方法在应用于活性物质包载时无法实现对其无损包载.研究者开发出多种优良的成胶方式，如酶催化、光照、小分子催化、蛋白或高分子添加物辅助等成胶法[39~44].近年来，我们课题组也发展了几种生物相容性良好的温和成胶方法，包括酶催化、二硫键断裂、氧化还原反应调控以及借助蛋白-多肽特异性结合力等成胶方法.借助于这些成胶方法能实现短肽水凝胶的可控制备和可逆调控，所得到的水凝胶也已经在药物递送、细胞三维培养、生物界面可控成胶、疫苗佐剂等领域显现了很好的应用前景.短肽水凝胶在药物递送、细胞培养、癌症抑制等领域的应用已经有较多的综述文章，在本文中，我们重点讨论短肽水凝胶在疫苗佐剂方面的应用.

短肽水凝胶在疫苗佐剂方面的应用是近几年的新发现.在现代疫苗工业中，蛋白和多肽等亚单元抗原由于更好的安全性、单一性、易大规模制造和储存等优点，被研究者和疫苗企业广泛研究.然而，亚单元疫苗由于免疫原性低，往往无法引起机体产生足够的免疫应答，这一不足制约了其在临床上的应用.因此，亚单元疫苗常与免疫佐剂共同使用，以提高机体的免疫应答.在近几十年的研究中，许多纳米材料，如介孔二氧化硅、纳米粒子、聚合物胶束、高分子水凝胶等都已经被尝试作为免疫佐剂[45~51].这些佐剂与亚单元疫苗联用能提高抗体滴度，但大部分佐剂存在安全性差、大规模制备无法实现、与抗原复合工艺复杂等不足.短肽易于合成且生物相容性高，短肽自组装水凝胶有望成为优良的免疫佐剂.在这一研究领域，Collier带领的课题组开展了创新性的研究，他们发现一段含T细胞表位和B细胞表位的多肽组装成纳米纤维后能够引起小鼠强烈的免疫应答[35]. Tirrell等随后证明含有一种细胞毒性T细胞表位的两亲性自组装多肽形成的纳米材料能够在活体实验中提高免疫应答[52].然而，这些方法仍然需要把T或B表位肽与自组装多肽共价连接起来.我们最近的研究发现，一类短肽水凝胶简单地物理包裹DNA、蛋白、抗原肽等亚单元疫苗就能够引起小鼠产生强烈的体液免疫和细胞免疫应答.我们的发现能够推动短肽自组装水凝胶作为疫苗佐剂的实际应用.

本文主要总结了我们课题组最近在短肽水凝胶的温和制备方法以及水凝胶应用于免疫治疗两方面的研究工作，主要分为以下2个部分阐述：(1)短肽自组装水凝胶的温和制备方法及其应用；(2)短肽水凝胶作为疫苗佐剂的应用.

1 短肽自组装水凝胶的温和制备方法及其应用

实现短肽由溶液向凝胶转变的策略大致可分为2种：一是打破短肽成胶因子的两亲性，构筑水溶性良好的成胶因子前体分子，然后通过酶和小分子催化化学反应生成成胶因子.在这个过程中，反应得到的成胶因子通过非共价键作用力自组装形成纳米结构，包裹水分子形成水凝胶; 二是通过提高短肽自组装形成的纳米纤维之间的相互作用，使其相互交联实现由溶液向凝胶的转化.通过策略一，我们设计了酶催化、二硫键还原以及氧化还原催化等成胶方法；通过策略二，我们设计了基于蛋白-多肽特异性结合力的成胶方法.

1.1 酶催化成胶方法

蛋白的磷酸化和去磷酸化在生物体内是一个重要的调节蛋白功能的生物过程，通常发生在蛋白的酪氨酸、丝氨酸和苏氨酸的侧链残基上, 在生物体内广泛存在将蛋白质磷酸化和去磷酸化的酶.我们将疏水的成胶因子2中的酪氨酸磷酸化[53]，得到较为亲水的成胶因子前体化合物1(图 1(a)). 1可以溶于水形成均一的溶液(图 1(b)), 加入碱性磷酸酶(ALP)后，95%以上磷酸基团被水解掉，转换成疏水化合物2，两者之间继而共同组装形成水凝胶(图 1(d))，由于成胶因子2不含有羧基或者氨基，该水凝胶在pH值0 ~ 12.0范围内都能稳定存在.化合物2本身难溶于水，通过常规的加热-冷却或pH调节的方法都无法溶解，只能形成沉淀(图 1(c)).通过引入磷酸基团，并使用去磷酸化过程控制成胶，是一种制备疏水化合物水凝胶的新策略，通过这一方法，我们将许多很疏水的抗癌药物制备成了水凝胶，显著提高了抗癌药物的药效和生物利用度[54~56].

1.2 二硫键还原成胶方法

除了磷酸化的方法，将短肽成胶因子与亲水性多肽相连接，也可以得到水溶性良好的成胶前体分子.成胶因子与亲水多肽之间通过易于断开的化学键相连，通过促发化学键的断裂，释放出成胶因子，得到水凝胶.我们因此设计了二硫键还原成胶方法[57]，如图 2(a)所示，将成胶因子(化合物3)和亲水多肽序列用二硫键链接得到成胶因子前体(化合物4)，使用温和的还原剂即可将二硫键还原断裂，如谷胱甘肽(GSH)，成胶因子化合物3被释放出来，形成相互交联的纳米纤维网络，形成水凝胶.这种方法可在37 ℃以及培养基等物质存在下实现水凝胶的制备，对于多数已报道出来的成胶因子也都具有普遍的适用性. GSH是一种内源性的细胞内抗氧化剂，因此，用GSH触发短肽的自组装对细胞不会产生大的毒性.因此，这种通过还原二硫键的成胶方法是一种生物相容的水凝胶制备方法，在细胞3D培养、组织工程、药物传递等研究领域能有很好的应用前景[58, 59].

1.3 氧化还原反应的可逆成胶方法

自然界中的自组装体系很多是动态可逆的, 然而大多数调控溶液-胶体之间转换的方法(pH调节、温度调控、超声、光照和化合物添加)不能被应用到体内.最近，清华大学张希课题组和许华平课题组合成了系列含硒元素的聚合物[60, 61], 能够通过氧化还原反应调节其自组装的性能，氧化还原过程由维他命C (vitamin C，VC)和双氧水(H2O2)调控.通过与他们合作，我们设计并合成了含有硒亚砜基团的化合物5 (图 3)，它在水溶液中能形成纳米球的结构，如图 3(a)所示；加入VC后，硒亚砜基团被还原，生成化合物6，其水溶性较化合物5差，自组装形成纳米纤维，进而形成水凝胶[62]，如图 3(b)所示.该水凝胶在加入双氧水过后又能转换成溶液，再次加入VC后又可恢复成水凝胶.这种胶体-液体之间的相互转换至少可以循环3次. VC和双氧水均可以在生物体内环境使用，该体系有望在生物体内实现溶液-凝胶间的可逆循环转变.

1.4 基于蛋白-多肽特异性相互作用的成胶方法

在自组装体系中，一些小分子能够组装形成纳米纤维、纳米棒或者纳米球等结构，如果这些纳米结构之间缺乏相互作用或者相互作用强度较低, 就只能形成分散的溶液，并不能形成水凝胶.在这种体系中，通过增强纳米结构之间的相互作用可以使纳米结构之间相互交联形成三维的网络结构，从而形成水凝胶.遵循这种规则，我们设计了一种基于蛋白-多肽之间相互作用的成胶方法[63].我们先设计了一个“四臂”ULD-TIP-1融合蛋白，其中每一个手臂可以与多肽序列WRESAI特异性结合.之后设计并合成了包含WRESAI序列的自组装短肽(化合物7，图 4中所化示).合物7在水溶液中能形成纳米纤维，但是由于形成的纳米纤维之间缺乏足够强度的相互作用，纤维之间几乎没有交联的节点(图 4(a))，使得整个体系呈溶液状态(图 4(b)).在体系中加入ULD-TIP-1蛋白，ULD-TIP-1蛋白的“手臂”能与不同纤维上暴露出来的-WRESAI序列结合，从而增强了纤维之间的相互作用(图 4(c))，最终促使了水凝胶的形成(图 4(d)).示意图(图 4(e))展示了多肽纤维之间通过蛋白交联的过程.通过调控蛋白的量或者改变多肽序列从而改变与蛋白的相互作用力能很好的调控所得到水凝胶的力学性能.这种成胶方法有助于制备多功能多肽自组装水凝胶，在药物释放以及细胞三维培养等方面有良好应用前景[64, 65].

2 短肽水凝胶作为疫苗佐剂的应用

2.1 作为DNA疫苗的纳米载体

为了克服传统的活体病毒或减活病毒作为疫苗的潜在风险，DNA等亚单元疫苗作为较为安全的替代品受到广泛关注.然而，DNA向细胞内的低转运效率制约了其应用，DNA疫苗必须与载体相互作用构建成DNA传递系统后注射才能增强免疫应答.现在科学家们已经构建出多种促进DNA高效进入哺乳动物细胞的传递系统，但是这些载体存在细胞毒性强、DNA载量低、复杂的制备过程导致的DNA活性降低等缺点制约了它们的临床应用.因此，制备一种既安全又高效的DNA传递系统仍然是一个挑战.

我们设计并制备了3个结构类似的短肽水凝胶Nap-GFFY-NMe (8), Nap-GFFY-OMe (9)和Nap-GFFY-OH (10)，差别在于多肽C端连接的基团不同，如图 5(a)所示. 3个水凝胶分别由其对应的磷酸化前体分子在碱性磷酸酶催化下制备.实验证明，8自组装形成了左旋的纤维结构，使得其形成的水凝胶能够浓缩DNA分子并保护它们免于降解(图 5(b)和5(c))，同时促进EGFP基因的融合质粒进入哺乳动物细胞中(图 5(d)).该水凝胶-抗原复合物能够显著提升疫苗HIV Env DNA (一段编码HIV-1包膜蛋白gp 145的DNA) IgG抗体滴度的提升，且通过肌内、皮下和静脉3种免疫接种方法均能提高机体的免疫应答(图 5(e)).作为DNA疫苗的传递系统，该水凝胶具有制备过程简单、高荷载量、优异的生物相容性和生物安全性等优点，为预防HIV等病毒感染的DNA疫苗制备提供了新的可选策略[66].

除了DNA疫苗以外，蛋白以及多肽等亚单位疫苗也是传统疫苗的替代者，它们同样有免疫原性低的不足.因此我们将疏水短肽(图 6(a)所示)与抗原蛋白通过非共价键共组装形成水凝胶，研究了其作为蛋白类抗原佐剂的效果[67]
选取成胶因子Nap-GFFY-OMe(9)以及它对应的D构型序列(11) (图 6(a)所示)，通过酶催化的方法与鸡卵清蛋白(ovalbumin，OVA)共组装，分别形成了L-gel和D-gel (图 6(b)和6(c)).结果显示，与铝佐剂相比，L-gel和D-gel分别提高IgG产量1.3倍和3.8倍，显著提升小鼠体内的免疫应答, 而且D-gel与L-gel相比，提升作用更为明显(图 6(d)).原因是D构型的多肽对体内的蛋白酶具有一定的抵抗力，这使得它们在体内比L构型的多肽更加稳定，具有更长的驻留时间.除了提升IgG的滴度以外，2种构型的水凝胶还具有促进抗原在淋巴结的富集，延长抗原在淋巴结的驻留时间，提高DC细胞对抗原的摄取量，促进DC细胞的成熟和促进生发中心的形成的作用.另外, D-gel能有效的激活细胞免疫，这对肿瘤、艾滋病、丙肝等重大疾病的治疗性疫苗的创制意义重大.不同于已经报道的将自组装多肽与抗原肽共价结合后组装的策略，我们设计了一种更为方便、更为实用的疏水短肽与抗原蛋白通过非共价键共组装形成纳米纤维的策略，有利于其未来的工业化生产与临床应用.

2.3 D构型的多肽水凝胶作为能够刺激CD8+T细胞响应的疫苗佐剂

机体的细胞免疫应答，尤其是CD8+ T细胞免疫应答，对免疫治疗十分重要，因为CD8+ T细胞免疫应答是能够直接杀伤细菌、病毒和肿瘤细胞的免疫过程.已经获得FDA批准的疫苗佐剂，如铝佐剂和油乳剂MF59等，只能够增强机体的体液免疫应答，而极少能够同时提高细胞的免疫应答.目前亟需开发能够诱导机体产生细胞免疫应答，尤其是具有杀伤作用的CD8+ T细胞免疫应答的疫苗系统.

为了解决这个问题，我们筛选了系列短肽水凝胶，在体内外评估其提升体液免疫和细胞免疫的能力，以期获得一种能作为肿瘤免疫治疗的水凝胶佐剂[68].实验发现，成胶因子Nap-GDFDFDY-OH(12) (图 7(a))形成的水凝胶免疫效果最好.该水凝胶与灭活后的肿瘤细胞简单的物理混合，即可制备成疫苗-佐剂复合物(图 7(b)).与其他对照组疫苗相比，使用该复合疫苗制剂免疫过的小鼠，IgG抗体滴度最强(图 7(c))，体内CD8+和IFN-γ+双阳性T细胞显著增多(图 7(d))，体内肿瘤得到更好的抑制，小鼠生存期更长(图 7(e)).我们同时证明该水凝胶是一种易于制备，并且能够同时激发机体中体液免疫和细胞免疫反应的疫苗佐剂，在肿瘤免疫治疗方面具有极大的临床应用潜能.然而，该佐剂激活免疫系统的机理需要进一步深入研究.

通过酶催化路径进行自组装，反应的环境非常温和，没有剧烈的温度变化，自组装分子皆处于较低的能量状态，分子振动较小，因而能够排列成在微观上更加规整有序的纳米结构.而常规的加热-冷却方法，加热后分子运动和振动剧烈，分子构型差异较大，在组装时势必会形成许多不规则的排列，得到的纳米结构有序度较差.这种有序度的差别最终会导致其生物活性的差别.因此我们使用2种路径调控同一短肽进行自组装, 分别得到纳米纤维和纳米球，考察了它们作为疫苗佐剂的免疫效果[69].

我们设计了2种D构型的自组装多肽Ada-GDFDFDY (13)和Ada-GDFDFpDY (14).分子13通过加热-冷却的方法形成纳米纤维，形成水凝胶(图 8(a)和8(b))；14在碱性磷酸酶的催化下转变成13, 最终自组装形成纳米球(图 8(a)和8(c)). CD和FTIR结果显示纳米球结构中的分子具有更加有序的多肽构型(图 8(d)).将2种形态的纳米材料作为佐剂免疫小鼠，结果显示纳米球组IgG滴度是纳米纤维组的6.5倍(图 8(e)).另外，体外促DCs细胞成熟实验显示，纳米球比纳米纤维刺激DCs细胞表达更多的细胞因子，如IFN-γ、IL-5、IL-6、TNF-α等(图 8(f))，表明纳米球刺激体液免疫和细胞免疫的能力更强.通过酶催化路径调控多肽自组装纳米结构的有序度，提升它们作为佐剂的效果，这是设计纳米材料佐剂的一种新策略，为疫苗佐剂的优化设计提供了更多的策略.

短肽水凝胶由于生物相容性好，易于设计与制备以及动态可逆的特性，在生物医药领域被广泛的研究.然而，短肽水凝胶最终是否能够在实际生活中占有一席之地，与传统的高分子水凝胶等比肩，成为不可或缺的生物材料，还需要进一步挖掘其特性，找到恰当的应用领域，并对其安全性开展更为系统和深入的研究.近年来研究发现，通过整合高分子水凝胶或者添加高分子、蛋白等生物大分子能有效的调控短肽水凝胶的力学强度、成胶性能、生物活性等.对这类复合、杂化水凝胶进行深入探索将能整合大分子与小分子的优势，推动短肽水凝胶的实际应用.

短肽水凝胶作为疫苗佐剂方面的优势是传统材料不具备的.水凝胶的特性使得其与传统抗原(减毒或灭活的病原体、肿瘤细胞等)之间可以通过物理混合简便地制备成免疫制剂；多肽自组装的特性使得其与半抗原共同组装(蛋白和多肽等)，以激发最优的免疫反应，达到更好的预防以及治疗效果.然而，短肽水凝胶作为佐剂提高免疫响应的机理目前还没有成熟的理论，需要更加深入的研究，才能在临床应用方面更进一步.

通过发展生物相容性良好的新型制备途径, 可以使多肽水凝胶做到无损包裹与释放活性物质，拓宽其应用方向，应用于组织工程，细胞的三维培养等.更重要的是，研究发现，通过对不同成胶路径的研究，多肽自组装得到的纳米材料微观形貌以及水凝胶的宏观性质会受到成胶路径的极大影响[69~76].首先，通过加热-冷却等方法得到的纳米结构规整度远远小于酶催化方法得到的纳米结构；其次，酶动力学会显著影响自组装短肽的空间构型(α-螺旋，β-折叠，无规卷曲等)；同时，不同温度下酶催化得到的纳米结构会呈现差别极大的宏观、微观结构，进而影响这些纳米结构的生物学功能.我们相信，通过成胶路径以及酶动力学调控短肽自组装结构和功能将是短肽自组装材料发展的一个新的重要方向.

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