细胞穿膜肽在药物递送系统中的研究进展
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作者:范 博 金明姬 黄 伟 王启明 高钟镐,文章编号: 0513-4870 (2016) 02-0264-08,期刊:药学学报,参考文献可阅读原文
摘要:
细胞膜是蛋白质、核酸及药物分子进入细胞的主要生物学屏障。近年来的研究发现细胞穿膜肽 (cellpenetrating peptides, CPPs) 能够有效地将小分子药物、蛋白质、肽类、核酸片段以及纳米载体 (如脂质体、聚合物胶束、无机纳米粒等) 转运穿过细胞膜。本文就细胞穿膜肽的分类及其在介导小分子药物、蛋白质及多肽、核酸和纳米载体特别是“智能”纳米载体等的转运入胞作用进行了讨论。
细胞膜是蛋白质、核酸及药物分子进入细胞的生物学屏障。如何将药物安全有效地递送至靶部位, 突破细胞膜屏障、促进药物进入细胞是药物递送系统尚需解决的主要问题。1988 年 Green 等[1]首次报道了HIV-1 的转录反式激活蛋白 Tat 具有穿透多种细胞膜的作用。随后, 一系列通过耗能或非耗能形式跨过多种细胞膜的小分子多肽 (其长度一般不超过 30 个氨基酸) 被发现, 并被命名为穿膜肽 (cell penetrating peptides, CPPs)[2]。这些穿膜肽能够内化进入哺乳动物、植物和细菌的细胞内, 有效地转导具有生物活性的分子、药物和药物载体穿过细胞膜[3−5]。
1 细胞穿膜肽的分类
CPPs 是一大类由 10~30 个氨基酸组成的短肽,也称为蛋白质转导域 (protein translocation domain, PTD) 或“特洛伊木马”肽 (Trojan horse peptides) 或转导肽 (transduction peptide) 等。到目前为止, 已发现了多种 CPPs, 主要包括转录反式激活蛋白 (Tat)[1]、VP22[6]、transportan[7]、模型两亲性肽 (MAP)[8]、信号转导肽[9]和富含精氨酸序列肽[10]。
大多数已知的 CPPs 不具备明显的组织特异性 或细胞类型特异性, 而是依赖于生理 pH 环境下氨基酸 (主要是富含精氨酸和赖氨酸等碱性氨基酸残基) 的正电荷序列和细胞表面带负电荷的糖蛋白之间的静电相互作用而发挥作用。在生理 pH 条件下精氨酸的胍头基可以和细胞表面膜上带负电的磷酸基和硫酸基产生氢键结合, 进而产生细胞内化作用。赖氨酸与精氨酸含有相同的净正电荷, 但不含有胍头基, 当其单独作用时穿过质膜的效果会差些。Lindgren 和Langel[3]发现肽序列中氨基酸的数量和次序 (主要是精氨酸) 决定着 CPPs 的转导性。因此, 根据它们在序列、疏水性和极性等方面的特征, CPPs 大致可以分为 3 类。
1.1 阳离子型肽
此类肽富含精氨酸, 具有高度净正电荷且几乎不含酸性氨基酸残基, 主要包括 R9[11]、Tat[12]、hLF[13]和 (RXR)4[14]等。研究表明阳离子 CPPs 需要包含至少 8 个正电荷才能有效地被细胞摄取[15]。阳离子 CPPs在进入细胞时一般不会引起细胞应答反应, 却会影响细胞膜的完整性和活性。
其中两种阳离子型肽值得一提, 第一种是核定位信号序列肽 (nuclear localization sequences, NLSs), NLSs 是一种较为特殊的阳离子型细胞穿膜短肽[7], 富含赖氨酸 (K)、精氨酸 (R) 或脯氨酸 (P) 残基, 可以穿过核孔复合体转运进入细胞核。NLSs 一般又可以分为两种: ① 单分型 NLSs (monopartite NLSs): 最初发现于猿猴病毒 40 (SV40) 大 T 抗原中, 它是 一段 4~8 个氨基酸组成的富含碱性氨基酸的短肽(PKKKRKV), 其核心序列可表示为 K(K/R)X(K/R); ② 双分型 NLSs (bipartite NLSs): 这类核定位信号以核质蛋白的核定位序列 (KRPAATKKAGQAKKKK) 为典型, 它是由两簇碱性氨基酸残基组成, 两簇碱性序列之间被 10~12 个非保守氨基酸残基间隔, 其序列通式可以表示为 R/K(X)10-12RRKK。由于大多数NLSs 的电荷数量恰好小于 8, 所以 NLSs 不是有效的CPPs, 但常被用来与疏水性肽序列共价连接以获得可以被有效摄取的两亲性 CPPs。还有一种是抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs), 抗菌肽是生物体防御外界病原体侵袭时产生的由基因编码、核糖体合成 的一类小分子活性多肽, 是生物体内先天性防御系统的重要组成成分。抗菌肽在进入细胞的过程中会损伤细菌的细胞膜, 具有杀菌剂的性质。在体外, 几分钟内就可杀伤革兰阳性菌、革兰阴性菌、寄生虫、病毒及肿瘤细胞。常见的抗菌肽有 LL-37、S413-PV 和Buforin 2 等。
1.2 两亲性肽类
由亲水结构域和疏水结构域构成, 其所带正电荷主要依赖于赖氨酸残基, 而两亲性的特征是由其一级结构和二级结构决定的。一级结构的两亲性 CPPs 一般分为两种: 一 种是疏水结构域与 NLSs 共价连接, 包括 MPG[16]、penetratin[17]和 CADY[18]等。以 MPG 为例, MPG (GALFLGWLGAAGSTMGAPKKKRKV) 的 亲 水 区是 SV40 NLS PKKRKV, 而疏水区则是源自 HIV 糖 蛋白 41 的融合序列, 两个区域通过 WSQP 连接键连接; 另一种则是全部由天然蛋白质分离获得, 如血管内皮−钙黏蛋白 (pVEC)[19]、ARF (1−22)[20]和 BPrPr (1−28)[21]。二级结构的两亲性 CPPs 具有 α-螺旋的空间构 象, 其亲水性氨基酸残基 (亲水端可以为阳离子、阴离子或极性基团) 和疏水性氨基酸残基分别位于螺旋结构的不同表面。富含脯氨酸序列或多聚脯氨酸序列的肽是此类肽的代表, 它们都含脯氨酸−吡咯烷基团[22], 在水中能形成螺旋状结构, 如包含 50% 脯氨酸残基、来源于玉米储藏蛋白的芳香箭头肽 (sweet arrow peptide, SAP), 其序列为 VRLPPP。
1.3 疏水性肽
此类 CPPs 仅含非极性残基, 目前仅发现少量的疏水性 CPPs, 比如从整合素 β3 中发现的信号序列VTVLALGALAGVGVG 以及卡波济成纤维细胞生长因子 (AAVALLPAVLLALLAP)[15]。一方面, 不同类型的 CPPs 具有不同的穿膜行为; 另一方面, 与 CPPs 相连的药物或载体的大小及理化性质、肽的长度和浓度以及细胞类型等因素都显著影响其穿膜效应。
2 细胞穿膜肽与药物或载体的连接方式
CPPs 能够输送种类繁多的物质进入细胞, 被转运物质的理化性质也不尽相同。因此, 需要不同的连接方法将 CPPs 与被转运物质连接。其中, 连接方式对 CPPs 在摄取水平和方式上有重要影响。
2.1 共价连接
共价连接是最常见的方法。通过稳定或可裂解的化学键 (如巯基−马来酰亚胺、酰胺键、二硫键和硫酯键) 将 CPPs 与被运送物质结合。在许多情况下, 尽可能地选择可裂解的化学键来保证被运送物质的释放而发挥其生物功能。例如, 二硫键是一种可逆性化学键, 在胞浆大量还原剂谷胱甘肽或还原酶的存在下, 二硫键可以发生断裂将被载药物释放。然而, 从化学观点来看, CPPs 共价连接技术在方法学上对被连接物有严格的限制, 并且可能改变被连接物的生物活性, 尤其是带电荷的寡核苷酸或 siRNA。
2.2 非共价连接
基于该方法与载体结合的大多数是两亲性 CPPs, 如 MPG 肽、Pep-1 肽与核酸、蛋白等, 还有阳离子型的 Tat 和寡聚精氨酸。非共价结合相对比较简单, 包括静电作用和疏水作用。运用非共价结合方法可以实现核酸和蛋白质等生物活性大分子的胞内递送并保留其生物活性。由于 CPPs 与核酸类药物进行化学连接存在困难, 因此 CPPs 介导的基因递送系统通常采用基于静电作用的非共价连接方式。但需要注意的 是, 与大分子量的阳离子聚合物相比, CPPs 的分子质量较小, 其结合并压缩核酸类药物的能力相对较弱, 所形成络合物的结构通常不够紧密而不利于基因转导。因此, 将 CPPs 与大分子阳离子聚合物共价连接后, 再通过静电作用的非共价连接方式与核酸类药物形成络合物, 能够获得较好的基因递送效率。
3 细胞穿膜肽在药物递送方面的应用
细胞穿膜肽具有强大的运输潜能, 迄今为止, CPPs 已经有效地介导了不同分子量和粒径的物质进入细胞, 如蛋白质、抗体、核酸 (寡核苷酸、cDNA、RNA 和 siRNA)、荧光染剂、纳米粒、病毒、量子点、磁共振成像造影剂和小分子药物等。
3.1 小分子药物
P-糖蛋白的过度表达是肿瘤多药耐药性的重要机制之一, Mazel 等[23]将 P-糖蛋白外排泵的底物多柔比星连接到 CPPs 上, 显著增加了多柔比星对脑肿瘤细胞的毒性作用。Lindgren 等[15]将甲氨蝶呤和两个不同肽类 (YTA2 和 YTA4) 相连, 结果表明, 与游离药物相比, 甲氨蝶呤-CPPs 共价物对靶酶二氢叶酸还原酶的作用提高了 15~20 倍, 同时体外多药耐药模型显示其可用于克服 MDA-MB-231 细胞对甲氨蝶呤的耐受性。Zhou 等[24]将 2', 5'-寡腺苷酸四聚物 (2-5A) 与短链 Tat 肽用化学方法结合产生 2-5A-Tat 嵌合体, 此嵌合体可以被细胞吸收并能在完整的细胞中活化核糖核酸酶。
3.2 肽类和蛋白质
蛋白质或多肽类药物可以用于许多疾病的治疗, 但是分子量大和亲水性极大地限制了它们透过细胞膜的能力而导致其生物利用度低。近年来, 许多学者开始利用 CPPs 来介导肽类药物的递送, 其中 Tat、penetratin 和合成聚精氨酸等是常用的 CPPs。Perea等[25]通过噬菌体展示技术筛选得到一种可以抑制酪蛋白激酶 2 磷酸化的环状九聚氨基酸长肽—P15 (酪蛋白激酶 2 在人体许多肿瘤中表达异常), 将 Tat 与P15 相连后给予荷瘤小鼠瘤内, 结果发现瘤重大幅下降。与完整的免疫球蛋白 G (immunoglobulin G, IgG) 相比, 单链 Fv (single-chain Fv, scFv) 抗体片段血清半衰期短, 被肿瘤组织摄取也更为迅速, 但由于 scFv在组织中的滞留时间短导致其在肿瘤部位的净沉积剂量较低而明显限制了 scFv 在放射免疫疗法中的应用。为了提高 scFv 在肿瘤组织的摄取量和滞留时间, Jain 等[26]将 penetratin 和 Tat 分别与 scFv 相连, 结果发现给药后 24 h, 对照组 (未连接肽)、penetratin 组和 Tat 组在肿瘤组织中滞留百分比分别为 27.25%、79.84%和 48.55%, 且 Tat 组在正常肺部组织摄取量明显增加但 penetratin 组在其他组织中的摄取没有增加。
3.3 核酸
CPPs 也可以作为核酸类大分子如寡核苷酸类, 包括核酸肽 (PNA) 和 siRNA、质粒 DNA 等的载体, 在基因表达的调节中可以靶向作用于细胞质或细胞核[27, 28]。Davidson 等[29]将 penetratin 连接到 siRNA 有义链的 5'末端, 没有经过进一步纯化而将其有效地递送进入初级神经细胞中引起了蛋白产物的下调。Chiu 等[30]将 Tat 连接到 siRNA 上, 并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化结合物, 该结合物能够沉默报告基因的表达。
3.4 纳米载体
纳米载体较难跨过细胞脂质膜, 这大大地限制了其体内外应用, 但将 CPPs 与纳米粒相连形成复合体后往往能克服这种困难。
3.4.1 脂质纳米载体
脂质体是粒径为 50~1 000 nm的脂质囊泡, 被广泛用于药物载体。研究发现表面经Tat 肽修饰的、粒径约 200 nm 的脂质体可以有效地将药物递送到胞内[31], 而且药动−药效学结果表明, 递送效率与肽的数量、肽序列、细胞来源和培养时间相关。Torchilin 等[31−33]将 Tat 与脂质体相连, 与无 Tat肽修饰的普通质粒−脂质复合物相比, 体外实验表明Tat 肽−脂质复合物提高了质粒 pEGFP-N1 进入癌细胞的递送率和转染率。脂质体进入细胞 1 h 后仍在胞浆中保持完整的形态; 入胞后 2 h, 脂质体迁移进入细胞核周围区域; 9 h 后, Tat 修饰的脂质体开始在核周围区域分解。Khalil 等[34]将八聚精氨酸 (R8) 与脂质体相连并考察了 R8 不同修饰密度对脂质体的细胞摄取和胞内转运的影响。结果发现, 低密度 R8 修饰的脂质体主要通过网格蛋白介导的内吞作用进入细胞, 在溶酶体内发生降解; 高密度 R8 修饰的脂质体则主要通过巨胞饮作用进入细胞且不易被溶酶体降解, 脂质体上不同 R8 密度产生不同基因表达水平的原因主要是由不同的胞内转运途径所引起, 而不是由于细胞对脂质体的不同摄入量。研究者进一步将质粒DNA 压缩包入高密度 R8-脂质体, 基因表达提高了 3倍。Dasai 等[35]将 Tat 肽连接到固体脂质纳米粒上用于经皮给药。在体外细胞模型中, 通过激光共聚焦显微镜和拉曼共聚焦显微镜观察发现, 对照组纳米粒主要分布在毛囊层 (皮下深度约 80 μm), 经 Tat 修饰的纳米粒在毛囊层和表皮层 (皮下深度约 120 μm) 均可观察到; 与对照组相比, Tat-脂质纳米粒使塞来昔布的经皮渗透能力提高了 3~6 倍。
3.4.2 聚合物纳米载体
经 CPPs 修饰后的聚合物胶束或纳米粒为提高难溶性生物活性药物和核酸类药物的胞内递送提供了有效手段。与未经修饰的胶束相比, Tat 肽修饰的 PEG-PE 胶束增加了其与肿瘤细胞的相互作用, 给药浓度为 5 和 50 nmol·L−1 时, Tat-PEGPE 组都显著提高了紫杉醇对 MCF7 和 4T1 细胞的 毒性 (P<0.05)。体内研究发现, 通过对肿瘤组织进行TUNEL 检测, Tat-PEG-PE 组细胞凋亡更为明显[36]。Cheng 等[37]制备了一种 PEG-PLGA 纳米粒用于递送siRNA, 并在纳米粒表面连接了两种不同的配体: 叶酸和 penetratin。通过这两种配体发挥协同作用, 该 双功能化纳米粒与细胞的亲和性增加, 细胞对纳米粒的结合能力和摄取能力增强, 基因沉默效率提高。Han 等[38]将 PAMAM 树状大分子和 Tat 肽与细菌磁性纳米粒 (bacterial magnetic nanoparticles, BMPs) 相连, 构建了一种具有穿膜作用的靶向 siRNA 递送系统 (Tat-BMPs-PAMAM), 用于脑部肿瘤的基因治疗。与对照组相比, Tat-BMPs-PAMAM /psiRNA-EGFR 更好地下调了 U251 细胞的 EGFR 表达, 显著抑制了U251 细胞的增殖和侵袭能力。在 U251 裸鼠皮下瘤模型中, Tat-BMPs-PAMAM 治疗组的肿瘤生长速率减慢, 肿瘤蛋白 (EGFR、P-AKT、MMP-2/9、PCNA、VEGF、Bcl-2 和 cyclin D1) 表达显著下调, 细胞凋亡数量明显增加。Jiang 等[39]用 R8 与叶酸共同修饰了PEG 化聚乙烯亚胺 (0.6 kDa)-β-环糊精, 用于递送质粒 DNA。结果表明, 叶酸介导的入胞作用和 R8 介导的穿膜作用共同提高了质粒 DNA 体内外的转染率。此外, 经 Tat 修饰的壳聚糖纳米粒不仅可以有效地转染 pDNA[40], 而且递送功能性 siRNA 能显著抑制小鼠乳腺癌的生长和转移, 延长荷瘤鼠的生存期, 研究发现[41, 42]生理盐水组与裸 siRNA 组的小鼠在接种后第 56 天时全部死亡, 而纳米粒组的小鼠生存期延长至 69 天。
3.4.3 无机物纳米载体
近年来, 无机纳米载体以其独特的性质获得了研究者的广泛关注, CPPs 可以提高无机纳米载体 (包括硅、铁、金和银等材料制成纳米粒) 的胞内递送效率。Josephson 等[43]将粒径约为 40 nm 的右旋糖酐包衣的超顺磁性氧化铁纳米粒(SPIONs) 与 Tat 肽相连, 与未经修饰的纳米粒相比, 淋巴细胞对 SPIONs 的摄取效率提高了 100 倍左右。Santra 等[44]设计了一种粒径约为 70 nm、经 Tat 肽修饰的荧光纳米探针——Tat-异硫氰酸荧光素−硅纳米粒 (Tat-FSNPs), 它可以标记人肺腺癌 (A549) 细胞, 且能够有效地穿过大鼠的血脑屏障。Oh 等[45]研究了粒径在 2.4~89 nm 之间的 Tat 肽-PEG-金纳米粒的细胞 摄 取 和 胞 内 分 布 情 况 , 结 果 发 现 , 金 纳米粒(AuNP) 的细胞摄取依赖于纳米粒表面的穿膜肽, 但是 AuNP 的胞内定位则由其粒径决定。粒径介于5.5~8.2 nm 间的粒子只有部分被运送至细胞质内, 16 nm 以上的金纳米粒则不会进入细胞, 而是分布在细胞外围或细胞外发生聚集。
3.5 刺激响应型“智能”纳米载体
尽管 CPPs 具有相当大的临床应用潜能, 但是也存在一些重要的缺点和局限性。首先, CPPs 的特异性差, 可以进入任何与之接触的细胞内, 可能会对正常组织产生毒性。第二, 穿膜肽在到达靶部位之前存在体内稳定性问题。为了防止 CPPs 在血浆中发生酶解, 目前可采取的措施有: ① 对其进行空间保护; ② 使用具有蛋白酶抗性的 D 型肽取代 L-氨基酸形式; ③将 CPPs 包入“智能”纳米载体中, 在纳米载体运行的第一阶段, 非特异性 CPPs 被聚合物或靶向抗体空间保护 (即所谓的“隐藏”), 当到达靶部位后, 在局部环境的作用下, 载体表面的保护基团通过刺激敏感性共价键的断裂而与载体分离, 将 CPPs 暴露出来进而发挥其穿膜作用。临床研究发现, 肿瘤、梗死和炎症部位常常存在低 pH 值、高温和基质金属蛋白酶等“局部环境”, 加热、辐射、超声、射频和磁场等外界刺激常常可以用来触发 CPPs 的暴露。
Koren 等[46]设计了一种多功能刺激敏感性脂质体递送系统, 该系统在脂质体表面连接了 3 种基团: ①肿瘤特异性 2C5 单克隆抗体 (mAb 2C5); ② Tat 肽连接的短链 PEG; ③ 位于长链 PEG 和 PE 之间可降解的 pH 敏感性腙键。在正常生理 pH 下, Tat 分子被长链 PEG 和 mAb 2C5“隐藏”, 当短暂 (15~30 min)暴露于酸性环境 (pH 5.0~6.0) 后, 腙键断裂, PEG保护去除, Tat 肽暴露出来发挥其穿膜作用。这里的mAb 2C5 不仅可以介导载体对肿瘤的主动靶向, 而且可以提高载体与肿瘤细胞的相互作用, 与被“隐藏”的 Tat 肽发挥协同作用。在肿瘤细胞的酸性环境下, 与未经修饰的 Doxil 相比, 包载了阿霉素的这种多功能性载体, 提高了细胞对载体的摄取作用, 增强了药物对细胞的毒性。Lee 等[47]设计了一种“弹出”系统, 该系统是由两种嵌段聚合物自组装形成的: PLA3kDb-PEG2kD-b-polyHis2kD-Tat 和 polyHis5kD-b-PEG3.4kD。PLA3kD 嵌段构成了纳米粒的疏水核, 被 PEG2kD 和PEG3.4kD 组成的亲水壳所环绕。在正常生理 pH 下, polyHis2kD 处于非离子化状态, 与其相连的 Tat 肽分子紧密地绑定在纳米粒表面, 而被长链 PEG3.4kD“隐藏”; 当处于肿瘤的弱酸环境时, polyHis发生离子化作用使得亲水壳带正电。结果说明, 静电排斥作用克服了疏水作用, 引起 polyHis2kD-Tat 弹出表面, pH 触发的 Tat 肽暴露于肿瘤环境中。Wang 等[48]构建了一种纳米靶向复合胶束, 该复合胶束是将构象可变的聚谷氨酸−聚乳酸嵌段共聚物和 Tat 肽修饰的 PEGDSPE 嵌段共聚物通过自组装方式形成。在血液循环中, 聚谷氨酸链段可以屏蔽 Tat 肽的跨膜递送功能, 防止其针对正常细胞发挥跨膜递送作用。同时, 这种屏蔽作用还可以保护 Tat 肽, 防止其被酶解而失去跨膜递送活性。该复合胶束首先通过 EPR 效应在肿瘤组织内蓄积, 实现被动靶向。然后, 在肿瘤组织弱酸性条件下聚谷氨酸链段发生构象转变暴露出 Tat 肽, 进一步发挥 Tat 肽的跨膜递送作用, 促进载体中药物吸收。聚谷氨酸的构象转变还可以在胶束外壳中形成通道, 加速药物释放。
在多功能性基因递送载体中常常出现纳米载体经 PEG 化修饰后产生细胞摄取量减少和核内体逃逸下降等问题, 因此有学者采用特异性配体、可裂解的PEG 系统或核内体融合/裂解肽等方式来克服。Kale等[11, 13]制备了一种载有质粒 pGFP 的 PEG 化脂质体, 该系统表面连接了 Tat 肽 (PE-PEG-Tat), 并用具有 pH敏感性酰腙键将 PEG 嵌段与 PE 相连 (mPEG-HZPE)。当脂质体在 EPR 效应下到达肿瘤部位后, 肿瘤细胞低 pH 的微环境使酰腙键断裂, 脱掉 PEG 外壳, 暴露出隐藏的 Tat 肽, 然后 Tat 肽再介导脂质体进入肿瘤细胞内。基质金属蛋白酶 (matrix metalloproteinases, MMPs) 是一组位于细胞外基质结构上具有极大同源性、能够降解细胞外基质蛋白的内肽酶总称。研究 发现[49]许多肿瘤组织的 MMPs 表达上调且酶催化反应可以放大 MMPs 的作用效应, 因此 MMPs 成为侵袭性和转移性肿瘤的理想靶点。Harris 等[50]开发了 一种基于 MMPs敏感和 EPR效应的磁性荧光纳米粒。研究者将被葡聚糖包裹的氧化铁磁性纳米粒通过对MMP-2 敏感的多肽片段 (GPLGVRGC) 与 PEG 相 连, 用来掩饰 CPPs。该纳米粒在血液循环中稳定, 避免了非特异性相互作用, 当纳米粒通过 EPR 效应蓄积在肿瘤部位后肿瘤组织中的 MMPs 促使对其敏感的化学键断裂, PEG 脱离将 CPPs 暴露, CPPs 介导的细胞穿膜作用被激活。该结果通过荧光和核磁共振成像得到了证实。
4 细胞穿膜肽应用的安全性问题
CPPs 为促进药物转运入胞开辟了一条新的途径, 但是若将其应用于临床尚有几个问题需要进行全面深入的研究: 第一, 明确 CPPs 的转运特征, 包括转运的机制、效率和动力学等; 第二, 阐明 CPPs 介导的药物递送系统在体内的组织分布和药动学; 第三, CPPs 进入体内后对组织和细胞潜在的毒副作用以及是否会引起机体的免疫应答反应等。
CPPs 一般通过作用于细胞膜和细胞器膜或与细胞组分相互作用而对细胞产生毒性[51, 52]。研究发现, 与细胞作用时间、CPPs 的长度和浓度、CPPs 相连载体种类和细胞类型等因素都会影响穿膜肽的毒性[53]。体外研究发现, 不同长度的 Tat 衍生肽其毒性随着长度和剂量不同而发生改变, Tat48−85 在较高浓度 (100 μmol·L−1) 时仍不会对 HeLa、CHO 和神经元细胞产生毒性[53−55], 但是 Tat37−60 在浓度较低 (100 nmol·L−1) 时即引起 HeLa GH、HL116 和 CCL39 细胞发生坏 死[56]。MAP 通过破坏细胞膜杀死微生物细胞[57]。当浓度超过 1 μmol·L−1时, MAP 对小牛主动脉内皮细胞产生较强的毒性作用[58]。
目前, 对 CPPs 的体外毒性评价较多, 但其体内毒性的考察受到限制。较少研究者针对 CPPs 的体内毒性、免疫原性及可能产生的不良反应进行较为系统和全面的评价。只有少数文献报道了 CPPs 应用于体内研究时所产生的毒性。Olson 等[59]发现 D-型寡聚精氨酸 (R9) 在静脉给药剂量大于5 μmol·kg−1时会引起严重的全身毒性, 小鼠因呼吸衰竭而死亡。Bolton 等[60]发现, 当penetratin剂量大于10 μg时会引起脑部神经细胞死亡和炎症细胞聚集, 但剂量为 1 μg 时显著减轻。而 Low 等[61]研究发现 penetratin 还会通过与 Toll样受体通路相互作用而影响内源性免疫系统。因此, 只有对 CPPs 的体内外行为进行全面深入评价, 才能防止其对正常组织产生不良反应, 只在靶部位发挥治疗作用。
5 展望
药物递送系统在到达靶部位前必须克服多重生物学屏障, 提高药物递送效率不仅可以减少给药剂量, 而且可以避免过量药物对正常组织产生的毒副作用。虽然 CPPs 在体内外实验中能够协助各类活性分子进入细胞内发挥作用, 为疾病治疗带来了新的希望, 但 CPPs 缺乏组织特异性和细胞类型特异性, 且在生理条件下易发生蛋白酶水解, 这些“缺陷”推动了基于生理学或微环境特征而设计定向于靶组织或靶细胞的“智能”递送平台的发展, 使其在细胞生物学、基因治疗、药物体内转运及细胞免疫学等研究领具有良好的应用前景。如何控制“智能”载体的响应灵敏度、克服较高的组织间质液压 (interstitial fluid pressure, IFP) 以及促进药物深入组织内部发挥药效等是基于 CPPs 的药物递送系统亟需解决的主要问题, 也是将此项技术应用于临床的关键所在。
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